Американские исследователи обнаружили ген, играющий ключевую роль в процессе истощения Т-лимфоцитов. В эксперименте на лабораторных мышах удаление этого гена повысило эффективность наиболее перспективной иммунотерапии рака с использованием лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами. Результаты работы опубликованы в Journal for Immunotherapy of Cancer.

Принцип технологии химерных антигенных рецепторов (сhimeric antigen receptor, CAR) состоит в том, что у собственных цитотоксических Т-лимфоцитов человека заменяют основной рецепторный комплекс (TCR + CD3), необходимый для распознавания чужеродных клеток, на CAR, специфичный по отношению к конкретному виду рака. Химерными такие искусственные рецепторы называют, поскольку они состоят из разных по происхождению модулей: фрагмента моноклонального антитела (scFv) для распознавания опухолевого антигена, шарнирной области, активирующего домена (CD3ζ), а также различных коактиваторов, регуляторов экспрессии и других трансгенов. Для получения CAR-Т-лимфоцитов из крови пациента забирают его собственные клетки, с помощью вирусного вектора вводят в них составной ген химерного рецептора, культивируют на питательной среде и вводят их обратно в организм. Там трансгенные лимфоциты распознают опухоль и активируются, атакуя ее клетки и выделяя цитокины — интерферон γ (ИФ-γ), фактор некроза опухолей α (ФНО-α) и другие, привлекающие различные иммунные клетки.

Т-лимфоциты с обычным (слева) и химерным (справа) рецепторами и их взаимодействие с клетками-мишенями
Т-лимфоциты с обычным (слева) и химерным (справа) рецепторами и их взаимодействие с клетками-мишенями

В клинических испытаниях CAR-Т-лимфоциты позволяли добиться полного излечения рака и предотвратить его повторное развитие у ряда пациентов. Однако подобных успехов удавалось достичь преимущественно при новообразованиях крови. Победить рак других тканей организма оказалось сложнее; одной из основных причин этого было быстрое истощение лимфоцитов в опухолевом микроокружении. Такие истощенные клетки постепенно утрачивают эффекторные функции, такие как синтез цитокинов (ИФ-γ, ФНО-α) и уничтожение раковых клеток, а также экспрессируют ингибиторные рецепторы PD1, Tim3 и LAG3. Предыдущие исследования показали (1,2), что дефицит регуляторного белка Cbl-b из семейства E3 убиквитинлигаз связан с отторжением опухоли, преимущественно за счет активности цитотоксических Т-лимфоцитов, однако точная его роль в этом процессе оставалась неуточненной.

Чтобы разобраться в этом вопросе и выяснить терапевтический потенциал воздействия на Cbl-b, группа ученых из нескольких исследовательских центров под руководством Венупрасада Пуджари (Venuprasad Poojary) из Юго-Западного медцентра Университета Техаса провела ряд лабораторных экспериментов.

Сначала исследователи выделили Т-лимфоциты из очагов искусственно привитого мышам рака толстой кишки и провели анализ их РНК с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени и иммуноблоттинга. Он показал, что истощенные клетки, экспрессирующие рецепторы PD1 и Tim3 (PD1+Tim3+), производят значительно больше Cbl-b (р = 0,00005), чем неистощенные (PD1-Tim3-).

Затем экспериментаторы «выключили» ген CBLB, кодирующий Cbl-b, в изолированных противоопухолевых PD1+Tim3+ Т-лимфоцитах с помощью технологии CRISPR-Cas9. Это восстановило продукцию цитокинов ИФ-γ, ФНО-α, интерлейкина-2 (ИЛ-2) и цитотоксичного фермента гранзима B (GrB) в истощенных клетках.

Чтобы изучить эффекты Cbl-b in vivo, мышам с наличием (CBLB+/+) и отсутствием (CBLB-/-) соответствующего гена привили клетки рака толстой кишки, экспрессирующие раковоэмбриональный антиген (РЭА, CEA) — биомаркер многих человеческих злокачественных новообразований. Оказалось, что у CBLB-/- мышей опухоль растет значительно медленнее (р=0,001) и сильнее инфильтрирована цитотоксическими Т-лимфоцитами. Также у таких животных оказалось гораздо меньше истощенных PD1+Tim3+ Т-лимфоцитов (18,4 против 45,6 процента), и они сохраняли способность синтезировать цитокины и GrB в отличие от клеток CBLB+/+ мышей.

Ограничение роста опухоли у мышей без Cbl-b
Ограничение роста опухоли у мышей без Cbl-b

Для оценки терапевтического значения Cbl-b исследователи снабдили CBLB+/+ и CBLB-/- Т-лимфоциты мышей химерным антигенным рецептором hCEAscFv-CD28-CD3ζ.GFP, распознающим человеческий РЭА (hCEA). Полученные CAR-Т-клетки ввели мышам с раком толстой кишки, экспрессирующим этот антиген. У животных, получивших CBLB-/- CAR-Т, наблюдалась гораздо лучшая выживаемость и меньший размер опухоли по сравнению с терапией CBLB+/+ клетками и отсутствием лечения.

Среди выделенных из опухолей CAR-Т-лимфоцитов CBLB-/- демонстрировали значительно меньшую «истощаемость» по сравнению с CBLB+/+ (4–6 против 30–35 процентов). Кроме того, они, в отличие от последних, сохраняли способность к уничтожению раковых клеток в культуре и синтезу ИФ-γ, ФНО-α и GrB. Таким образом, удаление CBLB потенцирует противоопухолевую активность CAR-Т-клеток, заключили исследователи.

Поскольку дефицит Cbl-b в Т-лимфоцитах связан с развитием аутоиммунных заболеваний, авторы работы провели дополнительное морфологическое и гистологическое исследование селезенки, толстой кишки, легких и печени получавших терапию мышей. Никаких признаков поражения не наблюдалось при использовании как CBLB+/+, так и CBLB-/- клеток.

Во всех экспериментах статистическую значимость результатов определяли как р< 0,05

Повышение эффективности CAR-Т-лимфоцитов путем удаления гена Cbl-b
Повышение эффективности CAR-Т-лимфоцитов путем удаления гена Cbl-b

«Наше исследование представляет собой важный шаг к разработке CAR-Т-клеток для борьбы с опухолями различных органов. [Такой подход] может преодолеть ограничения некоторых современных стратегий иммунотерапии рака», — отметил Пуджари.