Вскоре после объявления о том, что в США впервые отредактировали геном человеческих эмбрионов, в журнале Nature вышла статья с результатами эксперимента. Научный коллектив под руководством Шухрата Миталипова из Орегонского университета объявил, что им удалось успешно отредактировать патогенную мутацию в гене MYBPC3 при помощи технологии CRISPR/Cas9 и при этом избежать побочных эффектов. Статья находится в открытом доступе.

Принцип метода, который использовали ученые, заключается в направленном внесении изменения в ДНК вследствие репарации двуцепочечного разрыва. Разрыв осуществляет белок Cas9, а место для разрыва ему указывает направляющая РНК. Последовательность направляющей РНК выбирает экспериментатор. Для того чтобы разрыв залечился запланированным образом, в клетку необходимо ввести донорную ДНК-«заплатку», которая и содержит последовательность, намеченную экспериментатором для введения в ДНК организма. Подробней о том, как работает технология CRISPR/Cas и откуда она взялась, можно прочитать в нашем материале.

С момента выхода в 2012 и 2013 году первых статей по применению системы бактериальной CRISPR/Cas9 для редактирования генома эукариот, эта технология начала развиваться взрывными темпами. После успешного применения Cas9 для редактирования животных и растений, а также клеток человека, стало казаться, что технология достаточно отработана, чтобы приняться непосредственно за редактирование людей, точнее человеческих эмбрионов.

Несмотря на то, что подобные эксперименты в ряде стран были запрещены по этическим соображениям, в 2015 году группа китайских исследователей опубликовала пионерскую работу на эту тему. В своей статье ученые пытались исправить у эмбрионов (точнее в оплодотворенных зиготах) мутацию в гене β-глобина, приводящую к развитию тяжелого заболевания β-талассемии. Редактирование прошло с низкой эффективностью, кроме того, пилотный эксперимент показал два ключевых недостатка технологии — большое количество неспецифических разрывов, внесенных Cas9, и мозаицизм эмбрионов. Последнее означает, что из отредактированной зиготы развиваются эмбрионы, в которых у части клеток мутация присутствует, а у части нет.

В феврале этого года Национальная академия наук США опубликовала доклад, в котором признала необходимость разрешить редактирование эмбрионов для исправления мутаций, приводящих к развитию тяжелых наследственных заболеваний. В конце июля в прессе появилось сообщение о том, что подобный эксперимент в США проведен.

Эмбрионы, полученные в исследовании. Слева направо — зиготы, восьмиклеточные эмбрионы и бластоцисты
Эмбрионы, полученные в исследовании. Слева направо — зиготы, восьмиклеточные эмбрионы и бластоцисты

Редактирование эмбрионов осуществила группа из университета Орегона в сотрудничестве с коллегами из Кореи и Китая. В качестве модели ученые выбрали четырехнуклеотидную делецию в гене MYBPC3. Мутации в этом гене приводят к развитию гипертрофической кардиомиопатии. Это заболевание сердца встречается у одного из пятисот человек и является частой причиной смерти молодых спортсменов.

По сообщению авторов работы, им удалось восстановить нормальный генотип эмбрионов примерно в четверти процентов случаев. При этом из 58 эмбрионов только один оказался мозаичным, а нецелевых мутаций детектировано не было вовсе. Таким образом, американский эксперимент по сравнению с китайским можно назвать более чем результативным.

Одной из составляющих успеха стала удачная модель заболевания. Дело в том, что кардиомиопатия — доминантное заболевание, то есть для развития патологии достаточно одной копии мутантного гена. В своей работе авторы пытались вылечить гетерозиготные эмбрионы, полученные в результате оплодотворения здоровых яйцеклеток спермой больного донора. Кроме того, в работе исследователи применили два принципиальных нововведения, которые помогли им избежать побочных эффектов — нецелевого редактирования и мозаичности.

Для решения первой проблемы авторы использовали следующий подход. Традиционно Cas9 и направляющую РНК вводят в клетки в составе генетических конструкций. Оба компонента могут бесконечно синтезироваться с введенных кассет. С одной стороны, это повышает эффективность метода, то есть увеличивает вероятность внесения разрыва в нужном месте. С другой стороны, количество нецелевых разрывов тоже увеличивается. Чтобы избежать избыточного накопления нуклеазы Cas9, ученые на сей раз ввели в клетки сразу готовый белок, смешанный с молекулами направляющей РНК. Время жизни этих компонентов сильно ограничено, поэтому на ненужную побочную активность их не должно хватать. Действительно, выборочное секвенирование предполагаемых сайтов нецелевых разрывов и секвенирование экзома (то есть всей кодирующей части генома) подтвердило отсутствие лишней активности Cas.

Принципиальные схемы работы системы при введении Cas9 в оплодотворенную зиготу (сверху) и в неоплодотворенную яйцеклетку (внизу)
Принципиальные схемы работы системы при введении Cas9 в оплодотворенную зиготу (сверху) и в неоплодотворенную яйцеклетку (внизу)

Проблему мозаичных эмбрионов авторам тоже удалось решить, однако довольно спорным способом. Первый эксперимент американские исследователи провели на оплодотворенных зиготах и также столкнулись с мозаицизмом среди полученных эмбрионов. После этого было решено провести редактирование одновременно с оплодотворением. Сперматозоиды от донора, страдающего кардиомиопатией и гетерозиготного по делеции GAGT в гене MYBPC3, смешали с Cas9, направляющей РНК и ДНК-«заплаткой» и ввели в яйцеклетки, не несущие мутаций. Всего в эксперименте было получено 58 эмбрионов, которые подвергались редактированию, и 19 контрольных эмбрионов, в которые не вводили белок Cas9.

Согласно ожиданиям, половина контрольных эмбрионов, полученных в результате оплодотворения здоровых яйцеклеток, не содержала мутации. Из 58 опытных эмбрионов нормальные аллели содержали 42 эмбриона, то есть 72,4 процента. Учитывая, что половина из них изначально была здорова, эффективное редактирование прошло примерно в четверти случаев. Авторы работы указывают цифру в 22,4 процента. Для сравнения, в пилотной китайской работе эта цифра составила 7,4 процента.

Распределение генотипов эмбрионов в контроле, при редактировании оплодотворенной зиготы и при редактировании яйцеклетки одновременно с оплодотворением (слева направо). WT — нормальная аллель гена MYBPC3, Mut — мутантная аллель, Mos — мозаик, NHEJ — разрывы, неспецифично залеченные системой негомологичного соединения концов.
Распределение генотипов эмбрионов в контроле, при редактировании оплодотворенной зиготы и при редактировании яйцеклетки одновременно с оплодотворением (слева направо). WT — нормальная аллель гена MYBPC3, Mut — мутантная аллель, Mos — мозаик, NHEJ — разрывы, неспецифично залеченные системой негомологичного соединения концов.

Несмотря на многообещающие результаты, технология редактирования эмбрионов вызывает у экспертов много вопросов. Очевидно, что по сравнению с предшествующими работами китайских коллег в новой работе просто подобрана более удачная модель заболевания, в которой только одна копия гена является мутантной.

В ходе эксперимента авторам работы не удалось добиться редактирования при помощи ДНК-«заплатки» — оказалось, что мутация была исправлена с использованием в качестве матрицы «здоровой» копии, принадлежащей яйцеклетке. Как минимум, это ограничивает возможности для лечения только доминантных заболеваний. К тому же возникают вопросы о целесообразности генетического вмешательства в таких случаях — в описанном эксперименте исследователи имели возможность отобрать здоровый эмбрион и без всякого редактирования.

Схема с использованием неоплодотворенных яйцеклеток, несмотря на положительный результат, пока недоступна исследователям из других стран, например из Швеции, где также ведутся работы по редактированию эмбрионов. В США формально такие работы также запрещены. Однако в сопутствующем комментарии к статье поясняется, что в реальности их запрещено проводить на государственные деньги, а группу Миталипова финансировали частные компании. Поэтому не исключено, что пока бюрократические организации будут решать вопросы регуляции исследований на эмбрионах, в частных клиниках людей все-таки начнут редактировать.

Для тех, кто интересуется CRISPR/Cas безотносительно редактирования людей, сайт «Элементы» недавно подготовил обзор исследований за первое десятилетие использования этой системы.